Ретровирусы. Вирусология

Типы взаимодействия вируса с клеткой. Фазы репродукции вирусов.

Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой :

Продуктивный тип - завершается образованием нового поколения вирионов и гибелью (лизисом) зараженных клеток (цитолитическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма).

Абортивный тип - не завершается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов.

Интегративный тип, или вирогения - характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация).

Репродукция вирусов:

1.адсорбция вируса на клетке- прикрепления вирусов к поверхности клетки. Вирус адсорбируется на определенных участках клеточной мембраны - так называемых рецепторах.;

2. проникновение вируса в клетку -два способа: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорбции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транспортироваться в любом направлении в разные участки цитоплазмы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки;

3.«раздевание» вируса - удалении защитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. Конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нуклеиновая кислота вируса.;

3.биосинтез вирусных компонентов в клетке - Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства.

Реализация генетической информации вируса осуществляется в соответствии с процессами транскрипции, трансляции и репликации;

4. формирование вирусов - Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру:

1. Формирование вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм;

2. Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа);

3. Формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки;

4. Сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы);

5. выход вирусов из клетки- Первый тип - взрывной - характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип - почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки.

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом - фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размноже­нием - самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут раз­множаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные - путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра - нуклеоида.

Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элон­гация, или рост цепи, и терминация.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру - периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура - непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов :

1. лаг-фаза;

2. фаза логарифмического роста;

3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации

бактерий;

4. фаза гибели бактерий.

Лаг-фаза - период между по­севом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4-5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в раз­мерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеино­вых кислот, белка и других компонентов.

Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5- 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ра­нимы, что объясняется высокой чувствительностью компонен­тов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.

Затем наступает фаза стационарного роста , при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность вы­ражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.

Завершает процесс роста бактерий фаза гибели , характеризующаяся отмиранием бак­терий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжи­тельность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интен­сивность роста и размножения бактерий зависит от многих фак­торов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован­ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра­ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве­та, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питатель­ную среду и окрашивают её. Дру­гая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в орга­нических растворителях. И, нако­нец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пиг­менты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины яв­ляются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают ан­тимикробным, антибиотикоподобным действием.

Процесс репродукции вирусов условно можно разделить на 2 фазы. Пер­вая фаза включает 3 стадии : 1) адсорбцию вируса на чувствительных клетках; 2) проникновение вируса в клетку; 3) депротеинизацию вируса. Вторая фаза включает стадии реализации вирусного генома : 1) транскрипцию, 2) трансля­цию, 3) репликацию, 4) сборку, созревание вирусных частиц и 5) выход вируса из клетки.

Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. с прикрепления вируса к поверхности клетки.

Адсорбция представляет собой специфическое связывание вирионного белка (антирецептора) с комплементарной структурой клеточной поверхности — клеточным рецептором. По химической природе рецепторы, на которых фикси­руются вирусы, относятся к двум группам: мукопротеидным и липопротеидным. Вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы фиксируются на мукопротеидных рецепторах. Энтеровирусы, вирусы герпеса, арбовирусы адсорбируются на липопротеидных рецепторах клетки. Адсорбция происходит лишь при наличии определённых электролитов, в частности ионов Са2+, которые нейтрализуют из­быточные анионные заряды вируса и клеточной поверхности и уменьшают электростатическое отталкивание Адсорбция вирусов мало зависит от темпера­туры Начальные процессы адсорбции носят неспецифический характер, явля­ются результатом электростатического взаимодействия положительно и отрица­тельно заряженных структур на поверхности вируса и клетки, а затем наступает специфическое взаимодействие прикрепительного белка вириона со специфи­ческими группировками на плазматической мембране клетки. Простые вирусы человека и животных содержат прикрепительные белки в составе капсида. У сложно организованных вирусов прикрепительные белки входят в состав супер-капсида. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов), либо шипов, грибоподобных структур у миксо-, ретро-, рабдо- и других вирусов. Вначале происходит единичная связь вириона с рецептором — такое прикрепление не­прочное — адсорбция носит обратимый характер. Чтобы наступила необратимая адсорбция, должы появиться множественные связи между рецептором вируса и рецептором клетки, т. е. стабильное мультивалентное прикрепление. Количество специфических рецепторов на поверхности одной клетки составляет 10 4 -10 5 . Рецепторы для некоторых вирусов, например, для арбовирусов. содержатся на клетках как позвоночных, так и беспозвоночных, для других вирусов только на клетках одного или нескольких видов.

Проникновение вирусов человека и животных в клетку происходит двумя путями: 1) виропексисом (пиноцитозом); 2) слиянием вирусной суперкапсидной оболочки е клеточной мембраной. Бактериофаги имеют свой механизм проник­новения, так называемый шприцевои, когда в результате сокращения белкового отростка фага нуклеиновая кислота как бы впрыскивается в клетку.

Депротеинизация вируса освобождение геиома вируса от вирусных за­щитных оболочек происходит либо с помощью вирусных ферментов, либо с помощью клеточных ферментов. Конечными продуктами депротеинизации яв­ляются нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты, связанные с внутрен­ним вирусным белком. Затем имеет место вторая фаза вирусной репродукции, ведущая к синтезу вирусных компонентов.

Транскрипция — переписывание информации с ДНК или РНК вируса на и-РНК по законам генетического кода.

Трансляция — процесс перевода генетической информации, содержащейся в и-РНК, на специфическую последовательность аминокислот.

Репликация — процесс синтеза молекул нуклеиновых кислот, гомологич­ных вирусному геному.

Реализация генетической информации у ДНК-содержащих вирусов идёт так же, как и в клетках:

ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок

РНК транскрипция и-РНК трансляция белок

У вирусов с позитивным РНК-геномом (тогавирусы, пикорнавирусы) транскрипция отсутствует:

РНК трансляция белок

У ретровирусов — уникальный путь передачи генетической информации:

РНК обратная транскрипция ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок

ДНК интегрируется с геномом клетки-хозяина (провирус).

После наработки клеткой вирусных компонентов наступает последняя стадия вирусной репродукции сборка вирусных частиц и выход вирионов из клетки. Выход вирионов из клетки осуществляется двумя путями: 1) путём «взрыва» клетки, в результате чего клетка разрушается. Этот путь присущ про­стым вирусам (пикорна-, рео-, папова- и аденовирусам), 2) выход из клеток пу­тём почкования. Присущ вирусам, содержащим суперкапсид. При этом способе клетка сразу не погибает, может дать многократное вирусное потомство, пока не истощатся её ресурсы.

Методы культивирования вирусов

Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются ледуюшие живые объекты: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные мбрионы; 3) лабораторные животные.

Культуры клеток

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на 1) первичные (первично трипсинизированные), 2) полуперевиваемые (диплоидные) и 3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбрионштьные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу — на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток — это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассо­вой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получа­ют из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полу­ченные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные ) культуры клеток — клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфек­ций, так и при производстве вирусных вакцин.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бес­смертием и гетероплоидным кариотипом.

Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ, ПЭС, ВНК-21 — из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС — из почки морской свинки и др.) отдельные клетки которых об­наруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформиро­ванными.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачест­венные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Нер-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH — из почки человека.

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе росто­вых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, напри­мер, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все пита­тельные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированно­го солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред — сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и форми­рование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации.

При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избы­ток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в тер­мостате до выявления признаков размножения вируса.

Индикатором наличия вируса в заражённых культурах клеток может слу­жить:

1) развитие специфической дегенерации клеток — цитопатическое действие ви­руса (ЦПД), которое имеет три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток — симпластов; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;

2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гамагтлютинации (РГА);

4) положительная реакция гемадсорбции (РГАдс);

5) феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покры­вается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красно­го (фон — розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.

6) при отсутствии ЦПД или ГА можно поставить реакцию интерференции: ис­следуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В по­ложительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции по­ложительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Выделение вирусов в куриных эмбрионах.

Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста.

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоско-пировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка. Заражают кури­ные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предва­рительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом.

Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок. Выбор метода заражения зависит от биологиче­ских свойств изучаемого вируса.

Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбрио­на, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.

III. Выделение вирусов на лабораторных животных.

Лабораторные животные могут быть использованы для выделения виру­сов из инфекционного материала, когда невозможно применить более удобные системы (культуры клеток или куриные эмбрионы). Берут преимущественно новорождённых белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражают животных по принципу цитотропизма вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные — интрацеребрально, дерматотропные — на кожу.

Индикация вируса основана на появлении признаков заболевания у жи­вотных, их гибели, патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также по положительной реакции гемагглтотинации с экс­трактами из органов.

Не осуществляется бинарным делением. Еще в 50-х годах прошлого века было установлено, что размножение осуществляется методом репродукции (в переводе с англ. reproduce - делать копию, воспроизводить), то есть путем воспроизведения нуклеиновых кислот, а также синтеза белка с последующим сбором вирионов. Данные процессы происходят в различных частях клетки так называемого хозяина (к примеру, в ядре или цитоплазме). Данный разобщенный метод репродукции вирусов называется дизъюнктивным. Именно на этом мы и остановимся подробнее в нашей статье.

Процесс репродукции

Данный процесс имеет свои особенности репродукции вирусов и отличается последовательной сменой некоторых стадий. Рассмотрим их по отдельности.

Фазы

Вирусная репродукция в клетке осуществляется в несколько фаз, которые описаны ниже:

1. Первая фаза представляет собой адсорбцию вируса, о которой речь шла выше, на поверхности клетки, которая является чувствительной к этому вирусу.
2. Вторая представляет собой проникновение вируса в клетки хозяина методом виропексиса.
3. Третья - это некое «раздевание» вирионов, высвобождение нуклеиновой кислоты от капсида и суперкапсида. У ряда вирусов попадание нуклеиновой кислоты в клетки происходит методом слияния вирионной оболочки и клетки-хозяина. В данном случае третья и вторая фазы объединяются в единую.

Адсорбция

Под этой стадией репродукции вирусов подразумевается проникновение вирусной частицы в клетки. Адсорбция начинается на клеточной поверхности при помощи взаимодействия клеточных, а также вирусных рецепторов. В переводе с латинского слово "рецепторы" означает "принимающий". Они представляют собой специальные чувствительные образования, которые воспринимают раздражения. Рецепторы - это молекулы либо молекулярные комплексы, расположенные на поверхности клеток, а также способны распознавать химические специфические группировки, молекулы либо другие клетки, связывать их. У наиболее сложных вирионов такие рецепторы располагаются с внешней оболочки в виде шиповидного выроста или ворсинки, у простых вирионов они находятся, как правило, на поверхности капсида.

Механизм адсорбции на поверхности восприимчивой клетки основывается на взаимодействии рецепторов с так называемыми комплементарными рецепторами "хозяйской" клетки. Рецепторы вириона и клетки являются некими специфическими структурами, которые расположены на поверхности.

Аденовирусы и миксовирусы адсорбируются непосредственно на мукопротеиновых рецепторах, а арбовирусы и пикорнавирусы ― на липопротеиновых рецепторах.

У вириона миксовирусов нейраминидаза разрушает мукогфотеиновый рецептор и отщепляет N-ацетилнейраминовые кислоты от олигосахарида, который содержит в себе галактозу и галактозамин. Их взаимодействия на данном этапе обратимы, ведь на них значительно влияет температура, реакция среды и солевые компоненты. Адсорбции вириона препятствуют гепарин и сульфатированные полисахариды, несущие при этом отрицательный заряд, однако их ингибирующее воздействие снимается некоторыми поликарионами (экмолин, ДЭАЭ-декстран, протаминсулъфат), нейтрализующие отрицательный заряд от сульфатированных полисахаридов.

Попадание вириона в "хозяйскую" клетку

Путь внедрения вируса в чувствительную к нему клетку не всегда будет одним и тем же. Многие вирионы способны проникать в клетки методом пиноцитоза, что в переводе с греческого означает "пить", "выпивать". При данном методе пиноцитозная вакуоль будто бы втягивает вирион непосредственно внутрь клетки. Остальные вирионы могут проникать в клетку напрямую сквозь ее оболочку.

Контакт фермента нейраминидаза с клеточными мукопротеидами способствует попаданию вирионов в клетку среди миксовирусов. Результаты исследований последних лет доказывают, что ДНК и РНК вирионов от внешней оболочки не отделяются, т. е. вирионы проникают целиком в чувствительные клетки путем пиноцитоза или виропексиса. На настоящий момент это подтверждено в отношении вируса оспы, осповакцины, а также других вирусов, выбирающих средой обитания организм животных. Если говорить о фагах, они заражают нуклеиновой кислотой клетки. Механизм заражения основывается на том, что те вирионы, которые содержатся в вакуолях клеток, гидролизуются ферментами (липаз, протеаз), в процессе чего от оболочки фага освобождается ДНК и попадает в клетку.

Для проведения эксперимента выполнялось заражение клетки с помощью нуклеиновой кислоты, которая была выделена от некоторых вирусов, и вызывается один полный цикл репродукции вирионов. Однако в естественных условиях инфицирования при помощи такой кислоты не происходит.

Дезинтеграция

Следующий этап репродукции вирусов - дезинтеграция, которая представляет собой освобождение НК от капсида и внешней оболочки. После попадания вириона в клетки, капсид переживает некоторые изменения, приобретая чувствительность к клеточному протеазу, затем он разрушается, параллельно освобождая НК. У отдельных бактериофагов в клетки попадает свободная НК. Фитопатогенный вирус проникает через повреждение в клеточной стенке, а затем он адсорбируется на внутреннем клеточном рецепторе с одновременным высвобождением НК.

Репликация РНК и синтез вирусного белка

Следующим этапом репродукции вирусов является синтез вирусоспецифичного белка, который происходит с участием так называемых информационных РНК (у отдельных вирусов они находятся в составе вирионов, а у некоторых синтезируются только в зараженных клетках непосредственно на матрице вирионной ДНК или РНК). Происходит репликация вирусной НК.

Процесс репродукция РНК-вирусов начинается после попадания нуклеопротеидов в клетку, где формируются вирусные полисомы методом комплексирования РНК с рибосомами. После этого синтезируются и ранние белки, куда следует отнести репрессоры из клеточного метаболизма, а также РНК-полимеразы, которые транслируются с родительской молекулой РНК. В цитоплазме наиболее мелких вирусов, либо в ядре, образуется вирусная двунитчатая РНК методом комплексирования родительской плюс-цепи («+» - РНК-цепь) с опять синтезированной, а также комплементарной с ней минус-цепи («-» - РНК-цепи). Соединение данных нитей из нуклеиновой кислоты провоцирует образование лишь однонитчатой структуры РНК, которая называется репликативной формой. Синтезы вирусной РНК осуществляются репликативными комплексами, в которых принимают участие репликативная форма РНК, фермент РНК-полимеразы, полисомы.

Существует 2 вида РНК-полимераз. К таковым относятся: РНК-полимераза I, которая катализирует формирование репликативной формы непосредственно на матрице плюс-цепи, а также РНК-полимераза II, которая принимает участие в синтезе однонитчатой вирусной РНК на матрице репликативного типа. Синтез нуклеиновых кислот у мелких вирусов происходит в цитоплазме. Что касается вируса гриппа, то в ядре синтезируется внутренний белок и РНК. РНК выделяется затем из ядра и проникает в цитоплазму, в которой совместно с рибосомами начинает синтезировать вирусный белок.

После попадания вирионов в клетки, в них подавляется синтез нуклеиновой кислоты, а также клеточных белков. При репродукции на матрице в ядре синтезируется еще и-РНК, которая несет в себе информацию для синтеза белка. Механизм синтеза вирусного белка осуществляется на уровне клеточной рибосомы, а источником построения будет аминокислотный фонд. Активизация аминокислот осуществляется ферментами, при помощи и-РНК переносятся непосредственно в рибосомы (полисомы), в которых они располагаются уже в синтезированной молекуле белков.

Таким образом, в зараженных клетках синтез нуклеиновых кислот и белков вириона осуществляется в составе репликативно-транскриптивного сложного комплекса, который регулируется некой системой механизма.

Морфогенез вириона

Образование вирионов может произойти только в случае строго упорядоченного соединения структурных вирусных полипептидов, а также их НК. А это обеспечивается так называемой самосборкой молекул белка около НК.

Формирование вириона

Формирование вириона происходит с участием некоторых структурных компонентов, входящих в состав клетки. Вирусы герпеса, полиомиелита и осповакцины образуются в цитоплазме, а аденовирусы ― в ядре. Синтез вирусной РНК, а также формирование нуклеокапсида происходит непосредственно в ядре, а гемагглютинин формируется в цитоплазме. После этого нуклеокапсид перебирается из ядра в цитоплазму, в которой осуществляется образование оболочки вириона. Нуклеокапсид покрывается снаружи вирусными белками, а в состав вириона при этом включаются гемагглютинины и нейраминидазы. Именно таким образом происходит образование потомства, например, вируса гриппа.

Высвобождение вириона из "хозяйской" клетки

Из "хозяйской" клетки частицы вируса выделяются одновременно (во время разрушения клеток) либо постепенно (без каких-либо разрушений клеток).

Именно в таком виде и происходит репродукция вирусов. Вирионы высвобождаются из клеток, как правило, двумя способами.

Первый метод

Первый способ подразумевает следующее: после абсолютного созревания вирионов непосредственно внутри клетки они округляются, там образуются вакуоли, а затем разрушается и клеточная оболочка. По завершению этих процессов вирионы выходят все одновременно и полностью из клеток (пикорнавирусы). Данный способ принято называть литическим.

Второй метод

Второй способ подразумевает процесс освобождения вирионов по мере их созревания в течение 2―6 часов на цитоплазматической мембране (миксовирусы и арбовирусы). Выделению из клетки миксовирусов способствует нейраминидазы, разрушающие клеточную оболочку. Во время этого способа 75-90 % вирионов выходят спонтанно в культуральную среду, а клетки постепенно погибают.

Взаимодействие вирусов с клетками хозяев и репродукция вирусов.

Вирусы проходят в клетке сложный цикл развития. Морфогенез вирусов представляет собой основной этап этого развития и состоит из формообразовательных процессов приводящих к образованию вириона как заключению формы развития вируса. Онтогенез и репродукция развития вируса регулируется геномом.

В 50-х годах установлено, что размножение вируса происходит путем репродукции, т.е. воспроизведение нуклеиновых и белков с последующей сборкой вириона. Эти процессы происходят в разных частях клетки, например в ядре и цитоплазме (дизъюнктивный способ репродукции). Вирусная репродукция представляет собой уникальную форму, выражения чужеродной инфекции в клетках человека, животных, насекомых и бактерий.

Морфогенез регулируется с помощью морфогенетических генов. Существует прямопропорциональная зависимость между сложностью ультраструктуры вириона и его морфогенеза. Чем сложнее организация вириона, тем больший путь развития проходит вирус. Весь этот процесс осуществляется с помощью специальных ферментов. Т.к. вирусы не имеют собственного метаболизма то нуждается в ферментах. Однако у вирусов обнаружено свыше 10 ферментов, разных по происхождению и функциональному значению.

По происхождению: вирионные, вирус-индуцированные, клеточные, модифицированные вирусами. Первые входят в состав многих ДНК и РНК содержащих вирусов. ДНК-зависимая РНК-полимераза, протеинкиназа, АТФ-аза, рибонуклеаза, РНК-зависимая РНК-полимераза, экзонуклеаза и другие.

К вирионным формам относятся: гемоглютиннин и нейраминидаза, лизоцим.

Вирус-индуцирующие - это ферменты, структура которых закодирована в геноме, а синтез происходит на рибосоме хозяина - ранние вирионные белки.

Клеточные - включают ферменты клетки хозяина, не являются вирусоспецифическими, однако при взаимодействии с вирусами активность может модифицироваться.

По функциональному значению ферменты делятся на 2 группы:

• --- Участвующие в репликации и транскрипции;
• --- Нейраминидаза, лизоцим и АТФ-аза, которые способствуют проникновению вируса в клетку и выходу зрелых вирионов из клетки.

Репродукция вирионов характеризуется сменой стадий:

Транскрипция - переписывание ДНК на РНК - осуществляется с помощью фермента РНК-полимеразы, продуктами является биосинтез и-РНК. ДНК-содержащие вирусы, репродукция которых происходит в ядре, используют для транскрипции клеточную полимеразу. РНК-содержащие вирусы ф-ю и-РНК выолняет сам геном. У некоторых РНК-содержащих вирусов передача генетической информации осуществляется по формуле РНК-РНК-белок. К этой группе вирусов относятся - пикорновирусы, корновирусы.

Синтез белка происходит в результате трансляции в РНК.

Согласно современным данным различают 3 основных периода в цикле репродукции:

• 1. Начальный (подготовительный)
• 2. Средний (латентный)
• 3. Конечный (заключительный)

Каждый из периодов включает ряд этапов:

Первый этап

• 1. Адсорбция вируса на клетке.
• 2. Проникновение в клетку.
• 3. Депротеинизация (высвобождение нуклеиновой кислоты).

Второй этап

• 1. Биосинтез ранних вирусных белков
• 2. Биосинтез вирусных компонентов

Третий этап

• 1. Формирование зрелых вирионов
• 2. Выход зрелых вирионов из клетки.

1. Адсорбция - физико-химический процесс, является следствием разности зарядов. Эта стадия обратима на ее исход оказывает влияние кислотность среды, температура и другие процессы.

Основную роль в адсорбции вируса играет взаимодействие вируса с комплементарными рецепторами клетки. По химической природе они относятся к мукополипротейдам. На степень скорости адсорбции влияют гормоны действующие на рецепторы. Адсорбция вируса может и не наступить, что связано с различной чувствительностью клеток к вирусам. Чувствительность, в свою очередь определяется:

• - наличием в клеточной оболочке и цитоплазме ферментов, способных разрушить оболочку и освободить нуклеиновую кислоту.
• - наличием ферментов, материала, обеспечивающих синтез вирусных компонентов.
• 2. Проникновение вируса в клетку:

Вирус проникает 3 путями - путем непосредственного впрыскивания (характерно для фагов); путем разрушения клеточной оболочки (путь сплавления - характерно для вирусов растений); путем пиноцитоза (характерен для вирусов позвоночных).

3. Репродукция ДНК-содержащих вирусов.

Под воздействием ферментов у ДНК-содержащих вирусов осуществляется синтез и-РНК, и-РНК посылается на рибосомы чувствительной клетки. На рибосомах клетки начинается синтез ранних вирионных белков (наделены свойствами - ферментами, блокируют клеточный метаболизм).

Ранние вирионные белки дают начало образованию ранних вирионных кислот.

По мере накопления ранних вирионных белков они блокируют себя и процесс перестраивается на рибосомном аппарате. Идет сборка вирионов и вновь сформировавшиеся вирионы покидают клетку-мать.

4. Выход вириона из клетки:

1. Просачиваются через оболочку клетки и одеваются суперкапсидом, в состав в состав которого включаются компоненты клетки: липиды, полисахариды. В данном случае клетка сохраняет свою жизнедеятельность затем погибает. В некоторых случаях в процессе репродукции процессы могут происходить в течение нескольких лет, но жизнедеятельность сохраняется. При этом способе зрелые вирионы из клетки выходят постепенно и относительно длительно. Этот путь характерен для сложных вирусов, имеющих двойную оболочку.

Аномальные вирусы.

В процессе репродукции образуются различные аномальные вирусы. Усилиями академика Жданова в последние годы были открыты псевдовирусы, состоящие из РНК-вируса и белков клетки, образующих капсид. Они обладают инфекционными свойствами, но в силу особенности капсида не поддаются действию антител, образующих ответ на этот вирус.

Явление образования таких вирусов объясняется длительным вирусоносительством при наличии в организме специфических АТ.

Причинами формирования таких вирионов являются:

• 1. Высокая множественность, в результате чего клетка не в состоянии обеспечить все потомство энергетическим материалом.
• 2. Действие интерферона - он влияет на синтез ДНК и РНК вирусов.

Взаимодействие вируса с клеткой хозяина - это сложный многоступенчатый процесс, который начинается с адсорбции вирусных частиц на рецепторах клетки хозяина и продолжается после их проникновения внутрь клетки. В результате такого взаимодействия развивается либо продуктивная, либо абортивная, либо интегративная форма клеточной инфекции. При п р.о дуктивной форме происходит размножение, точнее репродукция (лат. reproduce-воспроизводить) вируса, при абортивной - ее нарушение на одном из этапов, при интегративной - интеграция вирусной нуклеиновой кислоты в клеточный геном.

РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ

Как отмечалось выше, вирусы являются самореплицирующейся формой, неспособной к бинарному делению, в отличие от микроорганизмов с клеточной организацией. В 50-х годах было установлено, что размножение, или репродукция, вирусов происходит путем репликации их нуклеиновой кислоты и биосинтеза белков с последующей самосборкой вириона. Этот процесс происходит в разных частях клетки - ядре или цитоплазме, вследствие чего получил название дизъюнктивного, т. е. разобщенного размножения.

Вирусная репродукция представляет собой уникальную форму выражения чужеродной (вирусной) информации в клетках человека и животных, насекомых, растений и бактерий, которая состоит в подчинении клеточных матрично-генетических механизмов вирусной информации.

1-я стадия - адсорбция - характеризуется прикреплением вириона к клеточным рецепторам, представляющим собой глико-протеины клеточной мембраны, содержащей нейраминовую кислоту. Такие рецепторы имеются у ряда клеток, в частности эритроцитов, на которых адсорбируются1 многие вирусы. Для орто- и парамиксовирусов специфическими рецепторами являются гликолипиды, содержащие сиаловую кислоту (ганглиозиды), для других - белки или липиды клеточной мембраны.

Рецепторами вирусов являются так называемые «прикрепительные» белки, располагающиеся в составе капсидов простых вирионов и суперкапсидов сложных вирионов. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов) или шипов (глико-протеиновые образования на внешней оболочке орто- и парамиксо-, рабдо-, арено- и буньявирусов).

Первый этап адсорбции определяется неспецифическими силами межмолекулярного притяжения, второй - специфической структурной гомологией или комплементарностью рецепторов чувствительных клеток и вирусов.

2-я стадия - проникновение вируса в клетку хозяина происходит путем виропексиса и слияния мембран. Виропексис есть не что иное, как частный случай рецепторного эндоцитоза, который состоит в инвагинации участка плазматической мембраны, где имеются углубления, покрытые рецепторами снаружи, на которых адсорбируется вирус (рис. 5.3). Затем происходит образование вакуоли вокруг вируса, в составе которой он находится в цитоплазме клетки хозяина. Описанный способ проникновения вирусных частиц характерен для аденовирусов, вируса гриппа и др.

Проникновение вирусной частицы в клетку хозяина может произойти и путем слияния мембран (рис. 5.4). В этом случае вирусная оболочка сливается с плазматической мембраной клетки хозяина, в результате чего внутренние структуры («сердцевина») вириона оказываются в цитоплазме зараженной клетки, а при слиянии с ядерной мембраной - в клеточном ядре.

3-я стадия - «раздевание» вирионов - заключается в их депротеинизации и освобождении от суперкапсида и капсида, препятствующих репликации вирусной нуклеиновой кислоты. «Раздевание» вириона начинается сразу же после его прикрепления к клеточным рецепторам и продолжается в эндоцитарной вакуоли и ее слиянии с лизосомами при участии протеолитических ферментов, а также в ядерных порах и околоядерном пространстве при слиянии с ядерной мембраной.

4-я стадия заключается в транскрипции и репликации вирусных геномов. Транскрипция вирусного генома двунитевых ДНК-содержащих вирусов происходит, так же как и клеточного генома, по триаде ДНК->- иРНК->- белок (рис. 5.5, а). Различия касаются только происхождения фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы, необходимой для данного процесса. У вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина (например, вирус оспы), имеется собственная вирусспецифическая РНК-полимераза. Вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре (папова- и аденовирусы, вирусы герпеса), используют содержащуюся там клеточную РНК-полимеразу II или III.

1. Вирусы с негативным геномом (минус-нитевые, рис. 5.5, б), к которым относятся орто-, парамиксо- и рабдовирусы (см. табл. 5.1), имеют в своем составе вирусспецифическую РНК-полимеразу или транскриптазу. Они синтезируют «РНК на матрице геномной РНК. Подобный фермент отсутствует в нормальных клетках, но синтезируется клетками, зараженными вирусами.

Он находится в составе как однонитевых, так и двунитевых РНК-содержащих вирусов.

2. У вирусов с положительным геномом к которым относятся пикорна-, тогавирусы и др.,функцию иРНК выполняет сам геном, который транслирует содержащуюся в нем информацию на рибосомы клетки хозяина.

3. Особняком стоит группа РНК-содержащих ретровирусов,в составе которых имеется обратная транскриптаза, или ревертаза. Уникальность этого фермента состоит в его способности переписывать информацию с РНК на ДНК. Этот процесс назывется обратной транскрипцией

Как отмечалось выше, количество генов в вирусном геноме весьма ограничено. Поэтому для увеличения количества вирусной информации существует своеобразный трансляционный механизм, функционирующий через иРНК, который передает значительно больше информации, чем записано в вирусной нуклеиновой кислоте. Это достигается разными путями, например при транскрипции информации с переписывающихся участков ДНК на «РНК путем сплайсинга (вырезание бессмысленных кодонов и сшивание концов), а также при считывании антикодонами гРНК одной и той же молекулы иРНК с разных нуклеоти-дов. При этом образуются новые триплеты, увеличивающие количество транслируемой информации.

Регуляция транскрипции осуществляется клеточными и вирусспецифическими механизмами. Она заключается в последовательном считывании информации с так называемых «ранних» и «поздних» генов. В первых закодирована информация для синтеза вирусспецифических ферментов транскрипции и репликации, во вторых - для синтеза капсидных белков.

Вирусспецифическая информация транслируется на рибосомы клетки хозяина, которые предварительно освобождаются от клеточных белков и собираются в вирусспецифические полисомы г-еплилацпл пируиныл геномов заключается в синтезе молекул ДНК или РНК, которые накапливаются в фондах этих нуклеиновых кислот, использующихся при сборке вирионов.

Репликация вирусной ДНК происходит на обеих нитях при участии клеточной ДНК-полимеразы. У однонитевых вирусов вначале образуется вторая нить (репликативная форма).

Репликация вирусных РНК происходит только при участии того же вирусспецифического фермента, который катализирует транскрипцию вирусного генома. У плюс-нитевых вирусов репликация РНК практически не отличается от их транскрипции. У минус-нитевых вирусов репликация отличается от транскрипции длиной образовавшихся дочерних молекул РНК. При репликации они полностью соответствуют по своей протяженности материнской нити, а при транскрипции образуются укороченные молекулы иРНК.

У ретровирусов репликация, так же как и транскрипция ДНК, происходит в составе клеточного генома при участии клеточной ДНК-полимеразы.

5-я стадия - сборка вириона - состоит прежде всего в образовании нуклеокапсидов. Поскольку синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков в клетке происходит в разных структурах клетки, необходима транспортировка составных частей вириона в одно место сборки. При этом вирусные белки и нуклеиновые кислоты обладают способностью узнавать и самопроизвольно соединяться друг с другом. В основе самосборки простых вирионов лежит способность вирусных полипептидов соединяться в капсомеры, которые, располагаясь вокруг осей симметрии, образуют многогранник. В других случаях полипептиды в виде спирали окружают вирусную нуклеиновую кислоту.

Многие простые вирионы собираются на репликативных комплексах- мембранах эндоплазматического ретикулума."У сложных вирионов сборка нуклеокапсида начинается на репликативных комплексах, а затем продолжается на плазматической мембране, с наружной стороны которой располагаются суперкапсидные гликопротеиды. Затем гликопротеидные и примыкающие к ним с другой стороны нуклеокапсидные участки выпячиваются через клеточную мембрану, образуя почку, как это имеет место у орто- и парамиксовирусов, рабдовирусов. После отделения почки, содержащей нуклеокапсид и суперкапсидные белки, образуются свободные вирионы. Они либо через клеточную плазматическую мембрану проходят во внеклеточное пространство, либо через мембрану эндоплазматического ретикулума проникают в вакуоль эндоплазматической сети. При этом мембранные липиды обволакивают почку, вытесняя из нее белки. Многие ДНК-содержащие вирусы, например вирус герпеса, собираются в ядре клетки на ее мембране, где образуются нуклеокапсиды. Затем они отпочковываются в перинуклеарное пространство, приобретая внешнюю оболочку. Дальнейшее формирование вириона происходит в мембранах цитоплазматического ретикулума и в аппарате гольджи, куда вирус транспортируется на поверхность клетки.

6-я стадия - выход вирусных частиц из клетки - происходит двумя путями. Простые вирусы, лишенные суперкапсида, например пикорнавирусы, аденовирусы и др., вызывают деструкцию клетки и попадают во внеклеточное пространство. Другие вирусы, имеющие липопротеидную внешнюю оболочку, выходят из клетки путем почкования, в результате чего в течение длительного времени она сохраняет свою жизнеспособность. Такой путь характерен для вируса гриппа и др.